Während sich wieder positivere Perspektiven für die am 27.9. in den USA beginnende Verhandlungsrunde abzuzeichnen schienen, kam es am 28.9. zu einem schweren Rückschlag, als nach einem Besuch des nationalistischen Likud-Führers Ariel Scharon auf dem Tempelberg gewalttätige Ausschreitungen begannen, die sich an den darauffolgenden Tagen auf verschiedene Städte im Westjordanland ausweiteten. Israelische Sicherheitskräfte wurden nach dem Freitagsgebet angegriffen und schossen mit scharfer Munition zurück. Zahlreiche Palästinenser wurden verletzt, vier starben in der »Schlacht um Jerusalem«. Der neue nach dem Tempelberg benannte Palästinenseraufstand (aqsa intifada) gewann rasch eine für Arafat nicht zu kontrollierende Eigendynamik und beendete jede Hoffnung auf eine rasche Friedenslösung. Bei den schlimmsten Unruhen seit 1993 starben bis zum Jahresende 2000 mehr als 350 Menschen, die große Mehrheit auf Palästinenserseite (darunter viele Minderjährige), zusätzlich gab es ca. 10000 Verletzte. Für die israelische Regierung war besonders beunruhigend, dass sich die arabischen Bürger Israels mit den Palästinensern solidarisierten.Die Bemühungen der internationalen Gemeinschaft um einen Waffenstillstand erwiesen sich als relativ nutzlos. Am 4.10.2000 traf sich US-Außenministerin Madeleine Albright mit Barak und Arafat in Paris. Dabei forderte Arafat eine internationale Untersuchungskommission über die Ursachen des Gewaltausbruchs, was von Israel zurückgewiesen wurde. Ab dem 6.10. kam es in Gaza und Westjordanland zu erbitterten Kämpfen, bei denen 10 Palästinenser getötet wurden. Das Josefsgrab in Nablus, das Israel kurz zuvor vertragsgemäß den palästinensischen Behörden übergeben hatte, wurde am 7.10. völlig zerstört. Israel schloss daraufhin bis zum 9.10. alle Grenzen. Nach israelischer Darstellung sei die Palästinensische Autonomiebehörde (PNA) ihren Verpflichtungen zum Schutz der heiligen Stätten nicht nachgekommen, dulde bewaffnete Gruppen und habe zahlreiche verurteilte Gewalttäter wieder auf freien Fuß gesetzt. Der diplomatische Druck insbesondere auf Israel verstärkte sich, als der UN-Sicherheitsrat am 7.10. in einer Resolution die exzessive Gewaltanwendung durch israelische Truppen verurteilte und die USA sich lediglich der Stimme enthielten, anstatt, wie bisher üblich, ihr Veto einzulegen.
Nachdem am 12.10. in Ramallah zwei israelische Soldaten gelyncht worden waren, antwortete Israel mit den bisher schwersten Angriffen unter Einsatz von Kampfhubschraubern auf Polizeiposten und Büros von Arafat in Gaza und Ramallah. Arafat bezeichnete die Angriffe als offene Kriegserklärung; Barak erklärte, er betrachte Arafat nicht länger als »Partner im Friedensprozess«. Trotz starkem innenpolitischen Druck für eine Fortsetzung des gewaltsamen Aufstands erklärte sich Arafat bereit, an einem Gipfeltreffen mit Barak sowie mit Clinton, Annan, Mubarak und König Abdullah von Jordanien in Sharm el-Sheikh teilzunehmen. Der Gipfel ging am 17.10. mit einer Vereinbarung zu Ende, in der sich beide Seiten gegenüber US-Präsident Clinton auf die Suche nach einer Friedenslösung und Israel zu einem Rückzug seiner Panzer und schwerer Waffen aus den Städten Westjordanlands verpflichteten. In der Frage der Untersuchungskommission willigte Arafat in die Entsendung einer fact-finding-Kommission ein. Am 26.10. löste ein Selbstmordattentat der Jihad eine neue Gewalteskalation in Gaza und Westjordanland aus. Nachdem Arafat am 29.10. eine Fortsetzung der Intifada angekündigt hatte, bis die palästinensische Flagge über Jerusalem wehe, bombardierte Israel am 31.10. erneut Basen und Büros von Arafats Geheimpolizei in Gaza. Die gewalttätigen Auseinandersetzungen zwischen israelischer Armee und palästinensischen Zivilisten und Polizisten hielten den November über an; nach schweren Kämpfen in Gaza am 13.11. wurde die Waffenruhe endgültig gebrochen (11 Tote auf beiden Seiten). Am 8.11. hatte Clinton den früheren US-Senator und Chairman des Nordirland-Abkommens George Mitchell als Vorsitzenden der internationalen fact-finding-Kommission benannt; sie begann am 11.12. mit ihren Untersuchungen vor Ort.
Am 14.11. gab Israel Wirtschaftssanktionen gegenüber der PNA bekannt: So wurde die Freizügigkeit im Westjordanland stark eingeschränkt und monatliche Steuerüberweisungen an die PNA stark reduziert. Bereits seit dem 7.10. war ca. 120000 Palästinensern die Einreise zur Arbeit nach Israel verweigert worden. Ein von Barak am 30.11. vorgelegter Friedensplan wurde von der PNA wegen seines Interimscharakters unmittelbar zurückgewiesen. Bei Gesprächen zwischen dem palästinensischen Chefunterhändler Saeb Erekat und dem israelischen Außenminister Ben-Ami ab dem 14.12. wurde erstmals seit Oktober wieder über die Kernprobleme des Friedensabkommens diskutiert: Status von Jerusalem, Siedlungen in Westjordanland und Gaza, Rückkehrrecht für palästinensische Flüchtlinge. Die Verhandlungen, die in den USA und später im ägyptischen Taba fortgesetzt wurden, blieben ohne konkretes Ergebnis.
Die militärischen Attacken im Rahmen der Intifada verlagerten sich seit Januar 2001 von der Straße hin zu gezielten und organisierten Angriffen der verschiedenen Milizen, die einerseits zahlreiche Todesopfer in der israelischen Zivilbevölkerung und insbesondere unter den Siedlern forderten, zugleich aber die Opferzahl unter den Palästinensern deutlich reduzierte. Nach der Wahl Scharons zum neuen Premierminister kam es am 8.–9.2. zu gewalttätigen Demonstrationen in Gaza und Westjordanland. Scharon hatte nach der Vereidigung der neuen Regierung seine Bereitschaft zur Fortsetzung des Verhandlungsprozesses mit der Bedingung verknüpft, dass die palästinensische Gewalt definintiv beendet werde. Daraufhin kam es ab Mitte März zu einer neuen Eskalation der Gewalt und der Verschärfung der totalen militärischen Abriegelung von A-Zonen-Städten im Westjordanland, vor allem Ramallahs, ab dem 11.3. Auf internationalen Druck hin wurden die Blockaden am 13.3. wieder gelockert. Am 20.3. war Scharon zu Gesprächen mit der neuen US-Regierung in Washington zusammengetroffen, die der Nahostfrage deutlich weniger Gewicht beimaß; der Posten des Nahost-Koordinators wurde nicht neu besetzt.
Der Führer des militärischen Flügels der Jihad, Iyad Khardan, wurde am 5.4. im Westjordanland durch eine ferngezündete Bombe getötet. Als die israelische Armee am 4.4. erstmals auf vollautonomes Gebiet (Zone A) eindrang und in Khan Yunis ein palästinensisches Flüchtlingslager angriff, kam es zu einer weiteren Eskalation. Am 2.4. hatte der Geheimdienst bereits sechs palästinensische Mitglieder der Force 17 innerhalb der Zone A entführt und drei von ihnen zwei Tage später wieder freigelassen. Nachdem die Besetzung eines Streifens im Nordosten des Gazastreifens durch die israelische Armee am 17.4. auf scharfe Kritik auch der USA stieß, zog sich die Armee wieder zurück. Zunehmend gingen radikale Siedler, ermutigt durch die Ankündigung Scharons, innerhalb bestehender jüdischer Siedlungen in Westjordanland 708 weitere Wohnungen zu bauen, auch eigenmächtig gegen Palästinenser vor. Am 3.4. kam es erstmals seit dem Regierungswechsel zu einem offiziellen Kontakt auf höchster Ebene, als Außenminister Peres in Athen mit dem palästinensischen Planungsminister Shaath zusammentraf. Nach Gesprächen zwischen Außenminister Peres und Mubarak am 28.4. in Kairo wurde deutlich, dass knapp zwei Monate nach Amtsantritt Scharons über ein Abrücken von einer Strategie der rein militärischen Unterdrückung der aqsa-Intifada nachgedacht wurde. Seit dem 1.5. kam es zu neuen Bombenanschlägen gegen jüdische Siedler und palästinensische Aktivisten. Am 3.5. rückte die israelische Armee bei Bethlehem in Zone-A-Gebiete ein und zerstörte palästinensische Stellungen. Nachdem mehrere jüdische Siedler von Palästinensern erschlagen und bei einer Bombenexplosion in der Nähe von Gaza zwei rumänische Gastarbeiter getötet wurden, beschoss die israelische Armee Gebäude des Geheimdienstes und der Fatah mitten in der Stadt Gaza. Die israelische Regierung bekannte sich am 13.5. offen zu einer Strategie gezielter Mordanschläge auf Aktivisten, da nur so massivere Schläge mit einer größeren Zahl ziviler Opfer vermieden werden könnten.
